Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE 3
1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE 4
1.2.1 Nguồn gốc 4
1.2.2 Phân loại 6
1.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 7
1.3.1 Cấu trúc bậc một 7
1.3.2 Cấu trúc không gian 9
1.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất 9
1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 11
1.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 12
1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 12
1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc 13
1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 15
1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 15
1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa 16
1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 16
1.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE 17
1.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 20
1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM 22
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25
2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 25
2.1.1 Chủng nấm 25
2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 25
2.1.3 Hóa chất 26
2.1.4 Môi trƣờng 26
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.1.5 Dung dịch và đệm 27
2.2 PHƢƠNG PHÁP 28
2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật 28
2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase 28
2.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase 30
2.2.4 Tinh sạch enzyme 32
2.2.5 Điện di SDS-PAGE 33
2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase 34
2.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số 35
2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 36
2.2.9 Xử lý số liệu 41
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42
3.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI
SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO 42
3.1.1 Tuyển chọn 42
3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA 43
3.2 TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE 45
3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian 45
3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy 47
3.2.3 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 48
3.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon 50
3.2.5 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen 52
3.2.6 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu 54
3.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE 55
3.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 55
3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE 56
3.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE 57
3.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất 57
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu 58
3.4.3 pH phản ứng tối ƣu 60
3.4.4 Độ bền nhiệt độ 61
3.4.5 Độ bền pH 63
3.4.6 Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ 64
3.4.7 Ảnh hƣởng của ion kim loại 65
3.4.8 Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa 67
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO 71
PHỤ LỤC 79
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 25
Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 26
Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm 27
Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein 33
Bảng 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori 43
Bảng 3.2. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng
A. awamori VTCC-F-099 79
Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian 79
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy 80
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất cảm ứng 80
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon 50
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô 80
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen 52
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate 81
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu 81
Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 81
Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE 82
Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 57
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase 82
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase 82
Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase 83
Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase 83
Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase 84
Bảng 3.19. Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase 85
Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase 86
Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của ion kim loại 66
Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase 86
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase 3
Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số
chủng vi sinh vật 8
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B)
của Cel12A từ H. grisea 9
Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea 10
Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các
enzyme thuộc phức hệ cellulase 11
Hình 2.1. Đƣờng chuẩn nồng độ glucose 30
Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 . 33
Hình 2.3. Đƣờng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn 36
Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu 42
Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA
tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng
XbaI và XhoI (C). 44
Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. awamori VTCC-F-099 45
Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian của chủng
A. awamori VTCC-F-099 46
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 48
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase
của chủng A. awamori VTCC-F-099 49
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 51
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 53
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 54
Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase
từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 56
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel
polyacrylamide 57
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 58
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 60
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 61
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 62
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 63
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 theo thời gian 64
Hình 3.18. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099. 65
Hình 3.19. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099. 68
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1
1 MỞ ĐẦU
Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào
thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy
cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến
tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp.
Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ
enzyme thủy phân cellulose (cellulase). Enzyme này tham gia phân cắt
ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và
một số loại polysaccharide tƣơng tự khác tạo thành các oligosaccharide.
Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc sản xuất bởi rất nhiều loại vi sinh vật
nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn có ở
thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài động vật không xƣơng sống
khác. Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có cấu trúc khác nhau. Điều
này dẫn tới sự khác nhau về hoạt tính xúc tác và điều kiện phản ứng tối ƣu
của các enzyme.
Hiện nay, việc sử dụng các enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase
trong một số ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp
chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giặt, sản xuất dung môi hữu
cơ và xử lý môi trƣờng là rất quan trọng, mang lại nhiều giá trị to lớn.
Tuy nhiên, những enzyme và chế phẩm có liên quan đƣợc sử dụng
trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam và một số nƣớc hiện nay chủ yếu
đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao. Vì thế, việc nghiên cứu, sản
xuất ra các chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp
thiết đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Nƣớc ta là
một nƣớc sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất các
enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase là rất phong phú. Xuất phát từ những lý do
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2
trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề
tài: “Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4-
glucanase” với các mục tiêu: (1) Tuyển chọn các chủng Aspergillus awamori
sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao và tìm môi trƣờng nuôi cấy thích hợp
để tạo endo-β-1,4-glucanase ngoại bào, (2) Tinh sạch đƣợc endo-β-1,4-
glucanase và đánh giá một số tính chất lý hóa của nó.
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3
2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết
-1,4-O-glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự khác.
Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và đƣợc xếp thành
3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase)
(EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và
β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [30], [39].
Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và
nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất đƣợc
thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.
Endo-β-1,4-glucanase là loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng
thủy phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và
một số cơ chất tƣơng tự khác thành các sản phẩm đơn giản hơn (các
oligosaccharide).
Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4
2.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE
2.2.1 Nguồn gốc
Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác
nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong
tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm
men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase.
Nấm mốc là một trong những đối tƣợng vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhất. Nhiều chủng nấm mốc thuộc
các chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã đƣợc
nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ:
Aspergillus niger [25], [26], A. flavus, A. fumigatus [27] A. terreus [29]
Trichoderma reesei [53], Penicillium persicinum, P. brasilianum [33],
Penicillium sp. [10], Phanerochaete chrysosporium [34].
Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng đƣợc xem là một trong những đối
tƣợng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase khá phong phú. Nhiều
loài vi khuẩn hiếu khí đã đƣợc nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ Acidothemus cellulobuticus [22], Bacillus
pumilis [32], Cellulomonas flavigena, C. udai [20], [21], Pseudomonas
fluoressens [42]. Không chỉ có các vi khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn
kỵ khí cũng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ
Clostridium [57].
Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có
khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ: Actinomyces griseus
[13], Streptomyces reticuli [61].
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét