Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp chung
Chỉ tiêu để đánh giá hoạt tính estrogen là định lượng hàm lượng estradiol tự
do trong mẫu huyết tương hay huyết thanh (test Elisa)
(3),(1)
và khảo sát sự
thay đổi của trọng lượng tử cung (test Astwood)
(7)
. Bên cạnh đó sự thay đổi
thể trọng của thuốc thử nghiệm trước và sau khi uống thuốc cũng được ghi
nhận.
Việc đánh giá này được thực hiện trên 2 cơ địa: Động vật bình thường và
động vật bị giảm chức năng sinh dục (cắt bỏ 2 noãn sào).
Khảo sát thời điểm nghiên cứu.
Liều cho uống: qua tham khảo và thử nghiệm cho thấy LD50 đường uống của
mầm Đậu nành trên chuột nhắt trắng là 500 mg/kg, các liều thử nghiệm được
chọn là 10 mg/kg và 50 mg/kg thể trọng. Bột được hòa trong nước cất và dầu
olive. Liều uống của thuốc đối chiếu là 0,5 mg/kg thể trọng, pha trong dầu
olive.
Tiến hành: Chuột được chia thành các lô, mỗi lô từ 10-15 con.
Chuột bình thường
Lô chứng uống nước cất.
Lô thử uống bột mầm Đậu nành liều 50 mg/kg.
Lô đối chiếu uống Estradiol valerate.
Chuột gây giảm năng sinh dục tiến hành tương tự như lô chuột bình thường,
nhưng lô thử có thêm liều 10 mg/kg.
Các chuột ở 2 lô được cho uống với thể tích là 10 mg/kg/ml. Thời gian cho
uống là 15 ngày
vào buổi sáng trước khi cho ăn. Sau thời gian thử nghiệm, tiến hành xác đinh
các chỉ tiêu sau:
Hàm lượng estradiol trong huyết thanh pg/ml (test Elisa).
Trọng lượng tử cung tính bằng g% (test Astwood).
Kỹ thuật định lượng Estradiol bằng test Elisa.
Nguyên tắc: Elisa là một kỹ thuật sinh hóa dựa trên nguyên lý chính là tính đặc
hiệu của kháng nguyên (KN)-kháng thể (KT) dùng để phát hiện các kháng
nguyên hay kháng thể (ở đây KN là estrogen, KT chính là KT của estrogen
được đưa vào để phát hiện nồng độ estrogen trong mẫu) trong thử nghiệm này
estrogen trong chuột nhắt là estradiol.
Kỹ thuật định lượng estradiol dựa trên sự tương tác cạnh tranh giữa estradiol và
liên hợp enzym-hormon đối với số lượng giới hạn của các kháng thể kháng
estradiol (trích tử thỏ) được cố định sẵn trong giếng của các bộ kit. Do đó
lượng gắn của liên hợp enzym-hormon sẽ tỷ lệ nghịch với hàm lượng estradiol
trong mẫu đo.
Sau khi ủ mẫu đo và liên hợp enzym-hormon trong các giếng của bộ kit, phần
liên hợp enzym- hormon không gắn sẽ bị loại bỏ bằng dung dịch rửa. Sau khi
cho chất nền màu xanh dương sẽ xuất hiện và màu này sẽ chuyển sang màu
vàng sau khi cho dung dịch dừng phản ứng. Cường độ màu-đo bằng hệ thống
máy Elisa tự động-là tỷ lệ nghịch với hàm lượng estradiol trong mẫu (dựa theo
đường cong chuẩn estradiol ở các nồng độ tăng dần).
Mẫu máu lấy ở đuôi chuột, vào buổi sáng, được đem ly tâm, lấy phần huyết
thanh cho vào ống đã chứa sẵn EDTA, tiến hành các bước cần thiết, đo bằng
máy Elisa ở bước sóng 450 nm trong 30 phút.
Trong báo cáo này chúng tôi sử dụng phương pháp Elisa sandwich.
Phương pháp Astwood
Tác động estrogen của thuốc thử nghiệm được đánh giá qua sự thay đổi
trọng lượng tử cung. Sau 15 ngày uống thuốc thử nghiệm ở 2 lô chuột (lô
bình thường và lô cắt bỏ noãn sào), tiến hành tách mổ tử cung, cân. Tính
trọng lượng trung bình của tử cung theo g%.
Tính toán kết quả
Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình M ± SEM (standard Error of
the mean: sai số chuẩn của giá trị trung bình). Và sử lý thống kê dựa vào
phép kiểm T-test với P ≤ 0,05 hoặc phép kiểm ANOVA với P ≤ 0,05.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng đường cong chuẩn của estradiol
Bảng 1. Độ hấp thu của các estradiol chuẩn có nồng độ tăng dần
Hàm lượng estradiol
chuẩn (pg/ml)
Độ hấp thu
0
25
100
250
500
1000
2000
2,583
1,862
1,282
0,701
0,318
0,161
0,115
Dựa vào bảng này ta vẽ được đồ thị, kết quả đo được của những mẫu thử sẽ
dựa trên đồ thị này.
Khảo sát hàm lượng Estradiol trong các lô thử
nghiệm bằng kỹ thuật Elisa
Khảo sát thời điểm nghiên cứu.
Qua khảo sát cho thấy thời điểm thích hợp cho uống là 3 tuần kể từ khi cắt 2
noãn sào. Khi đó hàm lượng estradiol nằm dưới giới hạn bình thường nhưng
chưa giảm đến tối thiểu (bảng 2)
Bảng 2. Hàm lượng estradiol ở chuột bình thường và chuột cắt 2 noãn sào sau
2, 3 và 5 tuần
P < 0,05 so với chuột bình thường
Nhận xét
Kết quả được thể hiện trên bảng
cho thấy hàm lượng estradiol sau 2
tuần của chuột cắt noãn sào và
chuột bình thường không có sự
khác biệt đạt ý nghĩa thống kê.
Sau 3 tuần cắt noãn sào hàm lượng
estradiol đã giảm đi gần như phân
nửa, đạt ý nghĩa thống kê so với chuột bình thường.
Hàm lượng estradiol của các lô chuột bị gây giảm năng sinh dục
Lô chuột thử
nghiệm N = 10-13
Hàm lượng
estradiol(pg/ml)
Bình thường
Cắt 2 noãn sào sau 2
tuần
Cắt 2 noãn sào sau 3
tuần
Cắt 2 noãn sào sau 5
tuần
8,911 ± 1,045
9,223 ± 0,423
5,617 ± 1,082*
2,830 ± 0,702*
Thử nghiệm được tiến hành trên lô chuột bình thường và chuột giảm năng
sinh dục, kết quả được thể hiện ở hình 1.
Hình 1. Đồ thị biểu diễn hàm lượng estradiol của các lô chuột bị gây giảm năng
sinh dục
Nhận xét
Hàm lượng estradiol của lô chứng cắt 2 noãn sào giảm đạt ý nghĩa thống kê
so với lô chứng bình thường, chứng tỏ mô hình nghiên cứu gây giảm năng
sinh dục đạt.
Hàm lượng estradiol của lô uống thuốc đối chiếu estradiol valerate liều 0,5
mg/kg cao hơn so với hàm lượng estradiol của lô chứng, đạt ý nghĩa thống
kê ở độ tin cậy 95%.
Hàm lượng estradiol của lô uống bột mầm Đậu nành liều 10 mg/kg cao hơn
so với hàm lượng estradiol của lô chứng nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê ở
độ tin cậy 95%. Hàm lượng estradiol của lô uống bột mầm Đậu nành liều
50 mg/kg cao hơn so với hàm lượng estradiol của lô chứng đạt ý nghĩa
thống kê ở độ tin cậy 95%. Do đó, sơ bộ kết luận rằng bột mầm Đậu nành ở
liều uống 50 mg/kg sau 15 ngày có tác dụng phục hồi sự giảm hàm lượng
estradiol trong những con chuột giảm năng sinh dục do bị cắt 2 noãn sào.
Hàm lượng estradiol của các lô chuột bình thường
Mục đích của thử nghiệm này là nhằm khẳng định xem sự tác động gián tiếp
của bột mầm Đậu nành có làm gia tăng hàm lượng estradiol trong máu của
thú thử nghiệm bình thương hay không. Kết quả được thể hiện ở hình 2.
Hình 2. Đồ thị biểu diễn hàm lượng estradiol của các lô chuột bình thường
Nhận xét
Hàm lượng estradiol của lô chuột bình thường uống thuốc đối chiếu
estradiol valerate liều 0,5 mg/kg cao hơn so với hàm lượng estradiol của
lô chứng, đạt ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%.
Hàm lượng estradiol của lô uống bột mầm Đậu nành liều 50 mg/kg
không khác nhau đạt ý nghĩa thống kê so với hàm lượng estradiol của lô
chứng. Do đó, phối hợp với kết quả ở phần
Chúng tôi kết luận rằng bột mầm Đậu nành ở liều uống 50 mg/kg sau 15
ngày chỉ có tác dụng phục hồi sự giảm hàm lượng estradiol trong những
chuột bị giảm năng sinh dục, không thể hiện tác dụng kiểu estrogen trên
chuột bình thường.
Khảo sát tác động của estradiol trên sự tăng trọng
Sự thay đổi trọng lượng của các thú thử nghiệm bình thường
Kết quả thử nghiệm được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3. Thay đổi (%) trọng lượng so với ban đầu ở chuột bị giảm năng
sinh dục
Lô thử
nghiệm
N = 10-15
Liều cho
uống
(mg/kg)
Trọng
lượng
so với
ban
đầu(%)
Chuột bình
thường
Chứng
10,743
±
2,762
Chứng
35.037
±
4.148#
Chuột cắt
bỏ
2 noãn sào
Bột mầm
Đậu nành
10
29.222
±
6.052
Bột mầm
Đậu nành
50
17.204
±
6.654*
ESTRADIO
L
0,5
2.974±
2.091*
Nhận xét
Thay đổi trọng lượng so với ban đầu (%) của lô chứng cắt 2 noãn sào tăng
đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường, chứng tỏ mô hình nghiên
cứu gây giảm năng sinh dục đạt.
Thay đổi trọng lượng so với ban đầu của lô uống thuốc đối chiếu
estradiol valerate liều 0,5 mg/kg nhỏ hơn so thay đổi trọng lượng so với
ban đầu của lô chứng, đạt ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%.
Thay đổi trọng lượng so với ban đầu của lô uống bột mầm Đậu nành
liều 10 mg/kg thấp hơn so với thay đổi trọng lượng so với ban đầu của lô
chứng nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. Thay đổi trọng
lượng so với ban đầu của lô uống bột mầm Đậu nành liều 50 mg/kg thấp
hơn so với thay đổi trọng lượng so với ban đầu của lô chứng đạt ý nghĩa
thống kê ở độ tin cậy 95%. Do đó, sơ bộ kết luận rằng bột mầm Đậu
nành ở liều uống 50 mg/kg sau 15 ngày có tác dụng giảm sự tăng trọng ở
những con chuột giảm năng sinh dục do bị cắt 2 noãn sào.
Sự thay đổi trọng lượng so với ban đầu của các thú thử nghiệm bị giảm
năng sinh dục
Kết quả thử nghiệm được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4. Thay đổi (%) trọng lượng so với ban đầu ở chuột bình thường
Lô thử
nghiệm
N = 10-15
Liều cho
uống(mg/kg)
Trọng lượng
so với ban
đầu (%)
Chứng
10,743
±
2,762
Bột mầm
Đậu nành
50
14.576
± 2.061
Chuột
bình
thường
Estradiol 0,5
6.891 ±
3.307
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét