Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes

5
MỤC LỤC
CHƢƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt viii
Danh sách các bảng ix
Danh sách các hình ix
Danh sách các sơ đồ x

1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích 1
1.3. Yêu cầu 1
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1. Tổng quan về probiotic 2
2.1.1. Định nghĩa về probiotic 2
2.1.2. Các chức năng sinh học của probiotic 2
2.1.2.1. Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme 2
2.1.2.2. Tổng hợp vitamin K và nhóm B 2
2.1.2.3. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột 3
2.1.2.4. Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất 3
2.1.2.5. Kích thích hệ thống miễn dịch 4
2.1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi 4
2.1.3.1. Trong nƣớc 4
2.1.3.2. Thế giới 5
2.2. Tổng quan về Lactobacillus sporogenes 5
2.2.1. Lịch sử phát hiện 5

6
2.2.2. Đặc điểm phân loại 5
2.2.3. Đặc điểm phân bố 6
2.2.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 6
2.2.4.1. Tế bào sinh dƣỡng 6
2.2.4.2. Bào tử 8
2.2.5. Những đặc điểm, chức năng sinh học tƣơng đồng giữa L. sporogenes và các vi
khuẩn Lactobacillus khác 9
2.2.5.1. Những đặc điểm trao đổi chất 10
2.2.5.2. Lợi ích trong dinh dƣỡng và trị liệu 13
2.2.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vƣợt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus khác
trong ứng dụng làm probiotic 15
2.2.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng L. sporogenes 18
3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 19
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 19
3.1.1. Thời gian 19
3.1.2. Địa điểm 19
3.2. Vật liệu nghiên cứu 19
3.2.1. Mẫu khảo sát 19
3.2.2 Môi trƣờng 19
3.2.3. Hóa chất 19
3.2.4. Thiết bị – dụng cụ 19
3.3. Nội dung đề tài 19
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.4.1. Tổng quan các bƣớc thực hiện đề tài 20
3.4.2. Phân lập vi khuẩn 20
3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào 21
3.4.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa 22
3.4.3.Khả năng sinh acid lactic 22
3.4.3.1. Định tính 22
3.4.3.2. Định lƣợng 23

7
3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử 24
3.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 27
4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
4.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes 28
4.1.1. Bố trí thí nghiệm 28
4.1.2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes 28
4.1.2.1. Quan sát khuẩn lạc 28
4.1.2.2. Quan sát hình thái tế bào 29
4.1.2.3. Quan sát hình thái bào tử 29
4.1.3. Đặc điểm sinh hóa của L. sporogenes 29
4.2. Khả năng sinh acid lactic 31
4.2.1. Định tính 31
4.2.2. Định lƣợng 32
4.3. Khảo sát khả năng hình thành bào tử 34
5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36
5.1. Kết luận 36
5.2. Đề nghị 36
6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

PHỤ LỤC











8
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ctv Cộng tác viên
CV Coefficient of variation, hệ số biến thiên
FDA Food & Drug Administration, cơ quan quản lý thực phẩm và
dƣợc phẩm của Mỹ
GRAS Generally Recognise As Safe, chứng nhận an toàn cho sức
khỏe
MRSA De Man-Rogosa-Sharpe agar
GYE Glucose Yeast Extract
SD standard deviation, độ lệch chuẩn





















9
DANH MỤC CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Những tƣơng đồng về mặt hình thái của L. sporogenes và Lactobacillus 6
Bảng 2.2 Những khác biệt về hình thái của L. sporogenes so với Bacillus 6
Bảng 2.3 Những tƣơng đồng về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes và
Lactobacillus 7
Bảng 2.4 Những khác biệt về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes so với
Bacillus 8
Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus 11
Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus 12
Bảng 2.7 Bảng liệt kê những ƣu điểm của L. sporogenes so với L. acidophillus 17
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn L. sporogenes . 24
Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn L. sporogenes 28
Bảng 4.2: Đặc điểm sinh hóa của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc từ chế phẩm . 30
Bảng 4.3 Khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa 31
Bảng 4.4: Giá trị độ Therner và lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sản xuất 33
Bảng 4.5 Số lƣợng bào tử L. sporogenes thu đƣợc trong 12 nghiệm thức đƣợc khảo sát 34
DANH MỤC CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1 Giản đồ cấu tạo bào tử 8
Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic 11
Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol 14
Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn L. sporogenes trên môi trƣờng GYE 38
Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn L. sporogenes đƣợc phóng đại 1000 lần dƣới kính hiển vi 29
Hình 4.3: Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn L. sporogenes 31
Hình 4.4: Thí nghiệm tạo acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes 32
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

10
SƠ ĐỒ TRANG
Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dƣỡng và trị liệu 13
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của L. sporogenes 20
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes 20
Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa 21
Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa 22
Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner 23
Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử L. sporogenes 25























11
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngành chăn nuôi Việt Nam hiện nay đang có những chuyển biến mới. Số lƣợng bầy
đàn ngày càng tăng và tình hình bệnh trong chăn nuôi ngày càng có nhiều diễn biến phức
tạp. Vì thế yêu cầu kiểm soát mầm bệnh đảm bảo sức khỏe cho thú nuôi là yêu cầu cấp
thiết. Bên cạnh đó, nhà chăn nuôi còn nhắm tới hiệu quả kinh tế tối đa trong sản xuất với
những chi phí tối thiểu. Đó cũng là mục tiêu của các nhà khoa học nhằm ứng dụng thành
quả nghiên cứu khoa học trong chăn nuôi.
Hiện nay, bệnh đƣờng tiêu hóa đã và đang gây nhiều tổn thất về mặt kinh tế cho các
nhà chăn nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh này đang dần hạn chế do những
tác dụng phụ. Liệu pháp thay thế cho kháng sinh là sử dụng probiotic (chế phẩm sinh học)
ngày càng đƣợc chú trọng. Probiotic là một hỗn hợp các vi khuẩn sống có lợi hay các
enzyme của chúng. Chúng có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh, làm cân bằng lại
hệ vi sinh vật đƣờng ruột, tổng hợp vitamin B, thúc đẩy sự tăng trƣởng của thú nuôi.
Trong hỗn hợp probiotic, mỗi vi khuẩn có một đặc tính có lợi riêng. Trong đó, nhóm vi
khuẩn Lactobacillus mà đặc biệt là Lactobacillus sporogenes với khả năng tạo bào tử sẽ
cho phép kéo dài thời gian bảo quản và tế bào sinh dƣỡng sau khi phục hồi vẫn có hoạt
tính ổn định. Nhờ vậy mà L. sporogenes ngày càng đƣợc ứng dụng nhiều trong sản xuất
chế phẩm sinh học.
1.2. Mục đích
Tìm hiểu một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes nhằm ứng dụng để
sản xuất chế phẩm vi sinh (probiotic).
1.3. Yêu cầu
Phân lập các chủng L. sporogenes từ các sản phẩm chế phẩm sinh học có sẵn.
Đánh giá khả năng hình thành bào tử trong điều kiện nhiệt độ và môi trƣờng nuôi cấy
thay đổi.




12
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3. Tổng quan về probiotic
2.3.1. Định nghĩa về probiotic
Thuật ngữ probiotic lần đầu tiên đƣợc đƣa ra bởi Lilly và Stillwell vào năm 1965 để mô
tả những yếu tố kích thích sinh trƣởng do vi sinh vật tạo ra [4]. Những nghiên cứu tiếp theo
giúp hoàn thiện dần định nghĩa về probiotic. Cho đến nay, theo Havenaar (1992) thuật ngữ
probiotic đƣợc hiểu là một loại hay hỗn hợp các vi sinh vật sống ảnh hƣởng có lợi đối với
động vật và ngƣời bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật có sẵn trong đƣờng
ruột vật chủ [4]. Những vi sinh vật đƣợc sử dụng làm probiotic là những vi sinh vật sống
trong tự nhiên bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và nấm men [2].
2.3.2. Các chức năng sinh học của probiotic
2.3.2.1. Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme
Vi sinh vật đƣờng ruột có lợi của động vật nuôi có một vai trò quan trọng trong sự
tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Chúng tham gia vào quá trình tiêu hóa các chất
dinh dƣỡng trong khẩu phần nhƣ: carbonhydrate, protein, lipid…thành những chất dễ
hấp thu hơn nhờ hệ thống enzyme của chúng nhƣ: amylase, protease, cellulase… Nhóm
này gồm những vi khuẩn: Bacillus subtilis, Ruminococcus, Cellulomonas,
Saccaromyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Lactobacillus,…
Theo một số nghiên cứu của Nahashon, việc bổ sung Lactobacillus vào trong khẩu
phần bắp, lúa mạch, đậu nành đã kích thích thèm ăn và tăng tích lũy mỡ, N, Ca, P, Cu
và Mn cho gà đẻ [2].
Ngoài ra, việc bổ dung chế phẩm Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà thịt
làm giảm hệ số chuyển đổi thức ăn trên 1 kg tăng trọng, ảnh hƣởng phần nào lên sức đề
kháng, làm giảm tỉ lệ chết, tăng hiệu quả sản xuất.
2.3.2.2. Tổng hợp vitamin K và nhóm B
Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin nhóm B nhƣ B1, B2, B6, B12 và
vitamin K ở manh tràng và đại tràng.

13
Bản thân tế bào nấm men có chứa một lƣợng dinh dƣỡng rất cao bao gồm: protein,
lipid, glucid, khoáng và nhiều vitamin nhất là vitamin nhóm B, cải thiện tăng trƣởng và
sức đề kháng.
2.3.2.3. Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất
Theo Rami và Khetarpaul (1998), probiotic có khả năng sản xuất các chất có tác
dụng trung hòa độc tố gây tiêu chảy của vi khuẩn E. coli, có thể làm giảm hoạt tính
urease trong ruột non, ngăn chặn sự tổng hợp các amin độc, làm giảm nồng độ NH
3

trong phân gia súc, gia cầm [27]. Một vài vi sinh vật có khả năng khử độc và phân hủy
một số chất có độc tính, tạo thành những dẫn xuất không độc. Nhiều nghiên cứu cho
thấy tế bào nấm men có tính khử các chất độc đƣợc sinh ra trong quá trình tiêu hóa nhƣ:
indol, skatol, phenol,… Tác dụng trung hòa và khử độc của probiotic không những giúp
cho ống tiêu hóa hoạt động tốt hơn mà còn có ý nghĩa về mặt môi trƣờng.
2.3.2.4. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột
Động vật khỏe mạnh, có hệ tiêu hóa hoạt động tốt là cơ sở cho sự chuyển hóa tốt
thức ăn phục vụ cho nhu cầu cơ thể. Đặc tính quan trọng nhất của một đƣờng tiêu hóa
khỏe mạnh là sự cân bằng của hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Việc bổ sung probiotic giúp
duy trì hệ vi sinh vật đƣờng ruột thông qua hoạt động cạnh tranh và đối kháng.
Hoạt động cạnh tranh thể hiện ở các vị trí bám dính trên nhung mao ruột, các chất
dinh dƣỡng và khối lƣợng các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu
chứng minh probiotic ức chế sự bám dính của vi sinh vật gây bệnh nhƣ E. coli,
Salmonella typhimurium [7, 19, 29]. Việc ức chế khả năng bám dính của vi sinh vật gây
bệnh giúp ngăn ngừa sự phát triển và gây bệnh của chúng.
Nhóm vi khuẩn lactic là những vi sinh vật tiêu biểu cho hoạt động đối kháng của
của probiotic. Chúng chống lại các vi sinh vật gây bệnh nhờ vào các sản phẩm do
chúng tạo ra nhƣ: bacteriocin, acid hữu cơ, hydroperoxydase, lactocidin,… Lactocidin
có phổ kháng khuẩn rất rộng. Các acid acetic và lactic làm giảm pH đƣờng ruột khiến
môi trƣờng đƣờng ruột trở nên bất lợi cho sự tồn tại của vi sinh vật gây bệnh Gr (-).
Một số bacteriocin thƣờng gặp nhƣ: mycobacillin, subtilin (do Bacillus subtilis sinh ra),
nizin (do Lactococcus lactis sinh ra), penicillin (do nấm penicillium sinh ra),…L.

14
acidophillus tạo ra lactacin B có tác dụng ức chế các loài Lactobacillus khác và
acidocin ức chế vi sinh vật gây bệnh [6, 34].
2.3.2.5. Kích thích hệ thống miễn dịch
Yếu tố đƣợc xác định có vai trò kích thích hệ thống miễn dịch là thành phần của
vách tế bào vi khuẩn: peptidoglycan. Sự phân hủy peptidoglycan tạo thành chất
muramyl peptid có tác dụng kích hoạt đại thực bào [32]. Saarela và ctv (2000) cho rằng
khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo sự tƣơng tác giúp probiotic tiếp xúc
với hệ thống lympho đƣờng ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn
dịch và tạo nên sự ổn định hàng rào bảo vệ ruột [28].
2.3.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi
2.3.3.1. Trong nƣớc
Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, việc sản xuất các chế phẩm cung cấp vi
sinh vật có lợi cho đƣờng ruột ở nƣớc ta không ngừng phát triển. Kết quả của các
nghiên cứu tìm hiểu ảnh hƣởng của các chế phẩm này lên sức đề kháng, tỉ lệ tiêu tốn
thức ăn, tỉ lệ chết, sức tăng trọng của gia súc, hiệu quả kinh tế… đƣợc ứng dụng trong
chăn nuôi ngày càng rộng rãi. Các công trình nghiên cứu của Viện Thú Y quốc gia:
Sữa chua và canh trùng B. subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của lợn con
(Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hƣng, 1962)
Viên Subtilis để phòng trị các hội chứng nhiễm khuẩn đƣờng ruột trên gia súc (Lê
Thị Tài và ctv, 1968 – 1978) [3].
Chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii cải thiện tình hình bệnh phân trắng ở lợn
con (Phan Thanh Phƣợng và ctv, 1979 – 1984)
Các chế phẩm trên đều khẳng định kết quả phòng trị bệnh đƣờng ruột ở heo và tác
dụng điều tiết kích thích sinh trƣởng của chế phẩm
Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và ctv đã sản xuất và thử nghiệm chế phẩm Subcolac
(Bacillus subtilis, Lactobacillus) làm giảm tỉ lệ tử vong , giảm tỉ lệ tái phát cho bệnh tiêu
chảy so với dùng kháng sinh và heo con tăng trọng tốt (cao hơn đối chứng 0,9 kg/con).
Phòng vi sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y trƣờng Đại Học Nông Lâm đã sản xuất thành
công chế phẩm Biolactyl, qua sử dụng đã cho hiệu quả tốt trong việc phòng bệnh tiêu
chảy cho heo con theo mẹ và hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi.

Xem chi tiết: Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes